Cdtrjyty

Для улучшения этой статьи желательно: Викифицировать статью.

Пластиковые кюветы с алюминиевыми электродами, используемые для электропорации

Доктор Эберхард Нойман - Электропорация Основатель

Электропорация — создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля. Это явление используется в биотехнологии для внедрения макромолекул (обычно ДНК или РНК) в клетки млекопитающих, бактерий или растений.

Усиление электрического поля при электропорации |

Явление электропорации основано на том, что мембраны обладают способностью концентрировать электрическое поле. Пусть между двумя плоскими параллельными электродами, находящимися на расстоянии L приложена разность потенциалов U и промежуток между ними заполнен слабо проводящим электролитом, тогда напряженность поля равномерно распределена по всему пространству между ними. А теперь поместим в центре ячейки бислойную липидную мембрану, которая обладает настолько высоким сопротивлением, что её можно рассматривать как непроводящий диэлектрик. Тогда вся разность потенциалов U окажется сконцентрирована на мембране.

Коэффициент усиления электрического поля, очевидно, будет равен L/h ~ 10^6, если выбрать L ~ 1 см, h ~ 5 нм. Таким образом, в согласии с экспериментальными результатами, достаточно приложить к электродам разность потенциалов порядка сотен милливольт, чтобы вызвать электропорацию бислоя. Если теперь между электродами находятся клетки с диаметром порядка 10 микрон, и мы хотим вызвать их электропорацию, придется приложить значительно более высокие напряжения. Действительно, в силу высокого сопротивления мембраны, раствор в клетке будет эквипотенциальным, то есть внешнее поле будет экранировано подвижными ионами, которые образуют диффузные обкладки двойных электрических слоев. Таким образом, на клетке скачок напряжения составит 2UR/L, которое будет сконцентрировано на мембране в области двух полюсов клетки. Если принять, что надо иметь, скажем 0.5 В, то приложить к электродам надо будет U ~L/R*0.5 В. Тем самым, имея L ~ 1 см, R ~ 5∙10^-4 см, получим U ~ (1∙0.5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 кВ. Поэтому в экспериментах с суспензиями клеток и липосом, приходится использовать специальные электропораторы, которые способны генерировать короткие импульсы амплитудой до 1-10 кВ.

При приложении к суспензии клеток импульсов электрического поля с напряженностью от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт на см и длительностью от десятков микросекунд до десятков миллисекунд удается вызвать резкий рост проводимости клеточных мембран [1]. После умеренной электрообработки проводимость клеток снижается до нормальных значений за времена от нескольких секунд до нескольких минут [2]. Более интенсивная электрообработка приводит к необратимому разрушению части клеток.

В экспериментах с клетками сложно контролировать напряжение, прикладываемое непосредственно к клеточной мембране. Кроме того, клеточная мембрана является чрезвычайно сложной системой. Основные барьерные функции мембраны выполняются фосфолипидным бислоем, который пронизан белками, выполняющими роль селективных каналов или активных насосов для ионов и метаболитов. Возможными причинами роста электропроводности могли бы быть изменения как в липидном бислое, так и в белках. Эксперименты c искусственной бислойной липидной мембраной (БЛМ) показали возможность её электрического пробоя при напряжениях близких к тем, при которых пробой наблюдается в клеточной мембране [3]. Было показано, что электрический пробой БЛМ определенного состава может быть обратимым [4]. Это указывает на то, что именно пробой по липидной компоненте ответственен за повышение проницаемости клеток [2]. Эксперименты с БЛМ показали, что электрический пробой возникает стохастично, и среднее время жизни мембраны нелинейно зависит от напряжения. Эти наблюдения привели к разработке теории образования и развития пор в жидких липидных бислоях в электрическом поле [2, 5]. В конце 1990-х годов удалось с помощью высокоточных измерений проводимости мембран зарегистрировать появление одиночных электропор в БЛМ [6]. Их средний диаметр составляет примерно 0.5 нм. В клеточных мембранах они были обнаружены с помощью электронной микроскопии [7].

Теория электропорации мембран |

Теория электропорации БЛМ предполагает, что в бислойной липидной мембране возникает локальная перестройка структуры, приводящая к появлению сквозного водного канала. Возможны две основных конфигурации поры — гидрофильная и гидрофобная. В гидрофобной поре стенки поры выстланы липидными «хвостами», а в гидрофильной поре — фосфолипидными головами. При малых радиусах энергетически выгодной является гидрофобная пора, при больших радиусах — гидрофильная пора. Вода обладает большей диэлектрической проницаемостью, чем липиды. Поэтому мембрана, содержащая поры, обладает меньшей энергией во внешнем электрическом поле. Этот выигрыш энергии пропорционален площади поры и квадратичен по её радиусу. При радиусе поры r* энергии гидрофобной и гидрофильной пор становятся равными. На энергетической кривой существует локальный минимум, отвечающий метастабильному проводящему состоянию бислоя, из которого он, с определенной частотой переходит в начальное невозмущенное состояние с низкой проводимость системы, или претерпевает разрыв. Скорость образования гидрофильных пор в липидном бислое единичной площади (Kc) можно описать следующим уравнением [5]
Kc=Aexp(αU2){displaystyle Kc=Aexp(alpha U^{2})}(1)
где
A=ν/aexp(−ΔW0/kT){displaystyle A=nu /aexp(-Delta W^{0}/kT)},
α=πr∗2(ϵw−ϵm)ϵ0/(2dkT){displaystyle alpha =pi r_{*}^{2}(epsilon _{w}-epsilon _{m})epsilon _{0}/(2dkT)}

Здесь, a — это площадь, приходящаяся на одну липидную молекулу, d — толщина бислоя, ϵ0{displaystyle epsilon _{0}} — диэлектрическая постоянная вакуума, ϵm{displaystyle epsilon _{m}} — диэлектрическая проницаемость бислоя,ϵw{displaystyle epsilon _{w}} — диэлектрическая проницаемость воды, k — константа Больцмана, ν{displaystyle nu } — частота латеральных флуктуаций липидных молекул, r∗{displaystyle r_{*}} — радиус поры, соответствующий переходному состоянию, T — температура, U — электрическое напряжение на бислое, ΔW0{displaystyle Delta W^{0}} — энергия активации поры в отсутствии электрического поля.

Предполагается, что скорость зарастания пор не зависит от приложенного электрического поля и от плотности пор на бислое. Данное предположение хорошо согласуется с экспериментально наблюдаемыми фактами [2] .

Доставка макромолекул в клетки при электропорации |

Описанные выше опыты фактически сводились к измерению электрического тока, переносимого малыми ионами через поры. Наряду с этим было установлено, что электрообработка способствует переносу через мембраны и макромолекул, размер которых превышает диаметр электропор [9]. Более того, отмечалась корреляция между электропорацией и переносом крупных молекул. Эта загадка была решена в работах [9, 10], где на примере транспорта молекул ДНК было доказано, что они способны расширять поры, которые затем медленно (~ 100 сек.) релаксируют к исходному состоянию. Кроме того, прямыми опытами там же было показано, что электрофорез ДНК играет важнейшую роль не только на стадии переноса этих молекул к клетке, но и при прохождении через мембрану. Электрическое поле буквально вдавливает плазмидную ДНК в малую пору, при этом расширяя её. Можно сказать, что сами молекулы плазмидной ДНК играют роль золотых микроскопических пуль, которые используются в методе «gene gun». Только движущие силы имеют разную природу — электрическую в первом случае, механическую во втором. Ещё одно важное новшество, реализованное в работах [9, 10] состоит в применении 2х-импульсной методики электрообработки, которая позволила разделить во времени две функции поля — электропорационную и электрофоретическую. Первый импульс был мощным, но коротким; затем следовал интервал переменной длительности и, наконец, включалось слабое постоянное поле. Введение ДНК перед первым импульсом приводило к высокой трансфекции и переносу крупных молекул декстранов, тогда как введение ДНК во время межимпульсного интервала не давало практически никакого эффекта.

В последнее десятилетие электропорацию стали применять для трансдермального переноса лекарственных веществ в организм человека. Электропорация лежит в основе нескольких методик трансдермального переноса, которые называют аквафорез, неинвазивная мезотерапия, безыгольная мезотерапия или безинъекционная мезотерапия[11].

Обеззараживание воздуха электропорацией |

Российский производитель обеззараживателей воздуха Поток Интер применяет эффект электропорации для уничтожения микроорганизмов в воздушной среде.

Ссылки |

1.Kinosita, K., Jr., and T. Y. Tsong. 1977. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature 268:438-441.

2. Weaver, J. C., and Y. Chizmadzhev. 1996. Theory of electroporation: A review. Bioelectroch Bioener 41:135-160.

3. Zimmermann, U., G. Pilwat, and F. Riemann. 1974. Dielectric breakdown of cell membranes. Biophys J 14:881-899.

4. Abidor, I. G., V. B. Arakelian, V. F. Pastushenko, M. R. Tarasevich, and L. V. Chernomordik. 1978. Electrical breakdown of lipid bilayer membranes. Dokl Akad Nauk SSSR 240:733-736. (Абидор И. Г., Аракелян В.Б, Пастушенко В. Ф., Тарасевич М. Р. и Черномордик Л.В 1978. Электрический пробой липидной бислойной мембраны. Доклады Академии Наук СССР 240: 733—736)

5. Glaser, R. W., S. L. Leikin, L. V. Chernomordik, V. F. Pastushenko, and A. I. Sokirko. 1988. Reversible electrical breakdown of lipid bilayers — formation and evolution of pores. Biochimica Et Biophysica Acta 940:275-287.

6. Melikov, K. C., V. A. Frolov, A. Shcherbakov, A. V. Samsonov, Y. A. Chizmadzhev, and L. V. Chernomordik. 2001. Voltage-induced nonconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer. Biophys J 80:1829-1836.

7. Chang, D. C., and T. S. Reese. 1990. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy. Biophys J 58:1-12.

8. Weaver, J. C. 1993. Electroporation — a general phenomenon for manipulating cells and tissues. J Cell Biochem 51:426-435.

9. Klenchin, V. A., S. I. Sukharev, S. M. Serov, L. V. Chernomordik, and Y. A. Chizmadzhev. 1991. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J 60:804-811.

10. Sukharev, S. I., V. A. Klenchin, S. M. Serov, L. V. Chernomordik, and Y. A. Chizmadzhev. 1992. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells — the effect of DNA interaction with electropores. Biophys J 63:1320-1327.

11. Безуглый А.П., 2008. Аквафорез – возможности неинвазивной мезотерапии. "Нувель эстертик" №6:170-179.